近年来，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域有了显著的进展。以Anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在治疗血液肿瘤方面取得了成功，而基于AAV载体的基因疗法也为罕见疾病带来了新的治疗选择。另一方面，CRISPR基因编辑技术的发展使基因治疗进入了一个崭新的时代，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，体内基因编辑疗法也展现了积极的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题引发了广泛关注。由于其直接作用于基因组DNA，任何不准确的编辑都有可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构提出了关于基因治疗安全性的指导原则，主要集中在两个方面：基因组完整性的评估，包括染色体重排、大段插入或缺失、外源DNA整合及其潜在致癌风险；识别脱靶编辑活动，包括类型、频率和位置。在本文中，将详细介绍多种脱靶检测技术。

脱靶效应（Off-target effect）指在基因编辑过程中，如CRISPR-Cas9工具除对目标序列进行编辑外，还可能错误作用于其他与目标序列相似的非目标位置，导致意外的基因组改变。为确保基因编辑的安全性和有效性，已开发多种方法用于检测和评估脱靶效应，这些检测方法可依据实验条件分为以下几类：

体内检测方法

体内检测方法是在活细胞或生物体内进行脱靶效应的评估，这些方法通常更接近真实的生物环境。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强大工具。其基本原理是向细胞引入一种双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物可插入到由Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点中。随后，利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而全面地发现潜在的脱靶编辑位置。GUIDE-seq因其高效性和准确性而受到广泛关注，迅速成为评估基因编辑特异性的标准方法之一。

✔ 优点：提供全面的基因组水平上的脱靶位点信息；直接检测体内真实的双链断裂事件，而非预测或体外模拟结果；能够检测到低频的脱靶事件。

✖ 缺点：实验操作相对复杂，要求较高技术水平；可能会错过不易被标记物插入的脱靶位点，对于某些难以转染的细胞类型实施难度较大。

➡ 应用场景：基因治疗安全性评估：确保CRISPR编辑的精准性，降低临床治疗中的脱靶风险。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种创新的方法，用于检测CRISPR-Cas9基因编辑过程中的脱靶效应。其原理基于监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化来揭示潜在的脱靶位点，从而在全基因组范围内定位脱靶位置。自推出以来，该方法因能够在活细胞环境中操作而受到关注，提供了更加真实的实验条件。

✔ 优点：能够在活细胞中实时监控Cas9-DNA相互作用；提供非侵入式检测手段，减少对细胞正常生理状态的影响；相比其他方法，具有更高特异性和准确性。

✖ 缺点：实验设计复杂，需要特定设备和技术支持；对于某些难以转染的细胞类型可能不适用；分析流程费时，需要专业知识。

➡ 应用场景：从基础研究到临床前试验的各领域，包括评估新开发的CRISPR工具的安全性、优化sgRNA的设计等。

体外检测方法

体外检测方法则是在实验室条件下，利用从生物体提取的成分或合成的材料进行的测试，这些方法能够提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的高通量测序方法，其原理基于在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9的切割作用。Digenome-seq已因其能够在全基因组范围内精确发现脱靶位点而受到广泛关注，为评估CRISPR-Cas9特异性提供了有效手段。

✔ 优点：能够在全基因组水平上无偏见地识别脱靶位点；提供比计算预测更高的准确性；无需复杂体内实验设置，操作相对简便。

✖ 缺点：可能遗漏仅在细胞内环境中发生的脱靶事件；需要大量起始DNA及高读取深度，成本较高；数据分析流程复杂，需要专业的生物信息学支持。

➡ 应用场景：验证新设计的sgRNA的特异性，比较不同Cas9变体或修饰版本效果，以及在临床前研究中评估基于CRISPR的治疗策略的安全性和有效性。

在探讨CRISPR技术的相关性时，尊龙凯时致力于推动基因编辑技术的创新与应用，同时也强调安全性评估的重要性。通过多种前沿的脱靶检测技术，我们可以有效降低潜在的脱靶风险，从而确保基因疗法的安全和有效性。期待更多的科研成果能够帮助提升基因编辑的可靠性，为生物医学领域开辟新天地。

尊龙凯时在基因编辑安全性评估平台方面积累了丰富的经验，涵盖靶点设计、靶点筛选、脱靶检测等多个环节。通过不断的技术创新与优化，尊龙凯时期望为客户提供优质、高效的服务与产品，助力基因医疗的未来发展。随着技术的进步，我们相信CRISPR及相关技术将在生物医疗领域展现出更大的潜力。