近年来，细胞与基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域取得了显著进展。其中，以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在血液肿瘤的治疗中展现出良好的前景，而基于AAV载体的基因疗法为罕见疾病开辟了新的治疗方向。另一方面，CRISPR基因编辑技术的迅猛发展更是让基因治疗进入了新纪元。目前，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，同时体内基因编辑疗法也已显示出良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性逐渐引起关注，因其直接作用于基因组DNA，任何不准确的修改都可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构提出了基因治疗安全性的指导原则，主要聚焦于两个方面：一是基因组完整性评估，包括染色体重排、大片段插入或缺失以及外来DNA集成的致癌性；二是识别脱靶编辑活动，包括类型、频率和位置。本文将围绕各类脱靶检测技术进行详细介绍。

脱靶效应（Off-target effect）是指在基因编辑过程中，使用CRISPR-Cas9等工具时，除了对目标序列进行编辑外，还可能错误地作用于其他与目标序列相似的区域，这会导致意外的基因组变化。为了确保基因编辑的安全性与有效性，已有多种方法被开发出来，用于检测和评估脱靶效应。这些检测方法根据实验条件可分为以下几类：

体内检测方法

体内检测方法是指在活细胞或生物体内进行的脱靶效应评估，这些方法通常更接近真实的生物学环境。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强有力工具。基本原理是通过向细胞内引入一双链寡核苷酸标记物（dsODN），此标记物可插入由Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点。随后，利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而整体发现潜在的脱靶编辑位置。这一技术自推出以来因其高效性和准确性而迅速成为基因编辑特异性评估的标准方法。

优缺点

✔ 优点：提供全基因组水平的脱靶位点信息；直接检测体内真实的双链断裂事件，而非预测或体外模拟结果；能够检测到低频的脱靶事件。

✖ 缺点：实验操作相对复杂，要求较高的技术水平；可能会错过那些不易被标记物插入的脱靶位点，对某些难以转染的细胞类型实施难度较大。

应用场景

基因治疗安全性评估：确保CRISPR编辑的精准性，避免临床治疗中的脱靶风险。CRISPR工具优化：筛选高特异性的sgRNA或改进Cas9变体。基础研究：研究DNA修复机制或CRISPR活性调控因素，常规脱靶检测等。

体外检测方法

体外检测方法是在实验室条件下进行的，使用从生物体提取的成分或合成的材料进行测试，这些方法能够提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的高通量测序方法。其原理是在体外利用纯化的基因组DNA模拟Cas9核酸酶的切割作用，通过将Cas9和sgRNA引入基因组DNA样本中进行消化处理，随后对消化后的DNA进行全基因组测序，并利用生物信息学工具识别和量化因Cas9造成的双链断裂位点，从而确定潜在的脱靶编辑位置。

优缺点

✔ 优点：能够全基因组范围内无偏见地鉴定脱靶位点；提供比计算预测更高的准确性；不需要复杂的体内实验设置，操作相对简便。

✖ 缺点：可能会遗漏那些仅在细胞内环境中发生的脱靶事件；需要大量的起始DNA及高级测序设备，且成本较高；数据分析流程复杂，需要专业的生物信息学支持。

应用场景

验证新设计的sgRNA的特异性，对比不同Cas9变体或修饰版本的效果，以及在临床前研究中评估基于CRISPR的治疗策略的安全性和有效性。

在这一背景下，尊龙凯时致力于打造一流的基因编辑安全性评估平台，涵盖靶点设计、靶点筛选、全面的脱靶检测及基因组重排检测等多项服务，以确保客户在细胞与基因治疗领域的创新成果。我们期待未来能开发出更多高效准确的脱靶检测手段，以进一步提升基因编辑技术的安全性和可靠性。